Минимальная ингибирующая концентрация мик. Основные понятия. (МИК) - минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация -наименьшая концентрация антибиотика,которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in. Минимальная планка цены

Наименование веществ	Уровень порогового значения (нг/мл)
Группа амфетаминов
Амфетамин
Метамфетамин
Метилендиоксиамфетамин (МДА)
Другие вещества амфетаминовой группы
Группа опиатов
Морфин
Кодеин
6-моноацетилморфин
Группа бензодиазепинов
Оксазепам
Диазепам
Нордиазепам
Мидазолам
Феназепам
Другие вещества группы бензодиазепина
Группа барбитуратов
Барбамил
Этаминал натрия
Химические вещества других групп
11-нор-Δ 9 -тетрагидроканнабиноловая кислота (основной метаболит Δ 9 -тетра-гидроканнабинола)
Кокаин и его метаболиты
Метадон и его метаболиты
Пропоксифен и его метаболиты
Бупренорфин и его метаболиты
d-Лизергид (ЛСД, ЛСД-25)
Фентанил и его метаболиты
Метаквалон
Фенциклидин

Таблица 2 приложения к Порядку проведения медицинского освидетельствования на состояние опьянения (алкогольного, наркотического или иного токсического) , утвержденному приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации (проект), "Уровни пороговых значений содержания наркотических средств, психотропных веществ, иных химических веществ и их метаболитов, определяемые методами подтверждающего анализа ".

Примечание: уровень порогового значения – это минимальная концентрация вещества (его метаболита) в биологическом объекте, определяемая методами предварительного или подтверждающего анализа, при выявлении которой результат исследования считается положительным.

Фактически аналогичная таблица под названием "Уровни порогового значения для подтверждающих методов анализа при исследовании мочи " приведена в Центральной химико-токсикологическая лаборатория при кафедре аналитической и судебно-медицинской токсикологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова (ЦХТЛ ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова) Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30 августа 2011 года № 179-25/12И, где, однако, кроме всего прочего указаны концентрации фенобарбитала (1" 000 нг/мл), других веществ из группы барбитуратов (100 нг/мл) и котинина (100 нг/мл). Согласно данному ЦХТЛ ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова, в соответствии с пунктом 2 приказа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 27.01.2006 года № 40 "Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ", разработала и утвердила требования к проведению химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека наркотических средств, психотропных и других токсических веществ".

В частности, согласно пункту 12 информационного письма при проведении медицинского освидетельствования водителей транспортных средств, тестировании учащихся, проведении химико-токсикологических исследований при обращении граждан и иных случаях, установленных законодательством, исследование жидкости ротовой полости (слюны) недопустимо, так как не позволяет достоверно установить факт наличия в организме человека наркотических средств, психотропных и других токсических веществ. Контролируемые вещества могут быть определены в жидкости ротовой полости (слюне) во временном интервале, не превышающем нескольких часов с момента употребления.

Требования к техническим средствам, применяемым с целью обнаружения наркотических средств, психотропных и иных токсических веществ (их метаболитов) в образцах мочи, при проведении предварительных химико-токсикологических исследованиях (приложение № 1 к Методическим рекомендациям: Правила проведения химико-токсикологических исследований на предмет наличия в организме обучающихся в общеобразовательных организациях и профессиональных образовательных организациях, а также образовательных организациях высшего образования в целях раннего выявления незаконного потребления наркотических средств и психотропных веществ наркотических средств, психотропных и иных токсических веществ (их метаболитов) / Разработчик: Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины» под редакцией главного внештатного специалиста по аналитической и судебно-медицинской токсикологии Минздрава России, д.х.н., профессора Б.Н. Изотова и главного внештатного специалиста по клинической лабораторной диагностике Минздрава России, д.м.н., профессора А. Г. Кочетова // Москва, 2015)

Наименование групп веществ	Концентрация (нг/мл)
Опиаты (6 моноацетилморфин, морфин, кодеин, дезоморфин и др.)
Каннабиноиды
Фенилалкиламины (амфетамин, метамфетамин, мефедрон и др.)
Метадон
Бензодиазепины
МДМА
Кокаин
Барбитураты
Котинин
Синтетические каннабиноиды
Катиноны
Этилглюкуронид

Требования к техническим средствам, применяемым с целью обнаружения наркотических средств, психотропных и иных токсических веществ (их метаболитов) в образцах мочи, при проведении подтверждающих химико-токсикологических исследований (приложение № 2 к указанному выше источнику)

Наименование групп веществ	Концентрация (нг/мл)
Группа амфетамина
Амфетамин
Метамфетамин
Метилендиоксиамфетамин (МДА)
Метилендиоксиметамфетамин (МДМА)
Другие вещества амфетаминовой группы
Группа опиатов
Морфин
Кодеин
6-моноацетилморфин
Другие вещества опийной группы
Группа бензодиазепина
Оксазепам
Диазепам
Нордиазепам
Мидазолам
Феназепам
Другие вещества группы бензодиазепина
Группа барбитуратов
Фенобарбитал	1000
Барбамил
Этаминал натрия
Другие вещества группы барбитуратов
Вещества других групп
11-нор-Δ9-тетрагидроканнабиноловая кислота (основной метаболит Δ9-тетра-гидроканнабинола)
Бензоилэкгонин (метаболит кокаина)
Метадон
Пропоксифен
Бупренорфин
ЛСД
Фентанил
Метаквалон
Фенциклидин
Котинин
Синтетические каннабиноиды
Катиноны
Этилглюкуронид

Вместе с тем, при осуществлении защиты по делам об административных правонарушениях по статьям 12.8 и 12.27 часть 3 КоАП РФ, а также по делам, предусматривающим уголовную ответственность при управлении транспортным средством в состоянии опьянения (статьи 264 и 264.1 УК РФ), не следует забывать, что административная ответственность наступает в случае наличия наркотических средств или психотропных веществ в организме человека вне зависимости от их концентрации в организме человека, в крови и в моче.

В силу изложенного выявление в рамках проведения наркологических экспертиз, химико-токсикологических исследований, судебно-химических исследований наркотических средств, психотропных и токсических веществ, и веществ, вызывающих опьянение, даже на уровне, так сказать, "предела обнаружения используемого метода" является основанием для привлечения водителя транспортного средства к административной или уголовной ответственности по соответствующим статьям Кодекса РФ об административных правонарушениях и/или Уголовного кодекса РФ.

Для информации - " "

Анализ способности бактерий размножаться и расти на средах, содержащих уменьшающуюся концентрацию лекарственного вещества, позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию антибиотика (МИК), угнетающую роль бактерий in vitro ( табл. 3(vet7)). Величина этой дозы определяет выбор лекарственного вещества, способного достигнуть аналогичных значений концентрации in vivo, и является основой для сравнения относительной чувствительности организма по отношению к другим лекарственным средствам. Считается, что для обеспечения эффективности воздействия концентрация лекарственного вещества в очаге инфекции должна быть по меньшей мере равной значению минимальной ингибирующей концентрации антибиотика. С другой стороны, концентрация лекарственного вещества в плазме обычно должна быть более высокой для обеспечения адекватной его концентрации в тканях. Однако неоправданное увеличение доз противомикробных препаратов с целью достижения минимальной дозы антибиотика, угнетающей рост бактерий определенного вида in vitro, может привести к накопленйю препарата в организме реципиента в токсичных дозах.

"Критической МИК" для конкретного лекарственного вещества является наибольшая достаточно безопасная концентрация препарата, которую можно достигнуть при помощи клинически приемлемой дозы и способа применения препарата ( табл. 3(vet7)). МИК зависит от конкретного вида бактериальной культуры и конкретного вида лекарственного вещества. В тоже время критическая МИК является специфической для конкретного реципиента и конкретного лекарственного вещества. Таким образом, критическая МИК будет одинаковой для любого организма ( табл. 3(vet7)). Критическое значение концентрации для конкретного организма может отличаться в зависимости от вида животного (из-за различий в чувствительности или в характере распределения лекарственного средства) и конкретной лаборатории. Необходимо обратиться в лабораторию, предоставляющую данные относительно методов культивирования и чувствительности к антибиотикам, с целью получения критических значений, используемых в ходе проводимых там исследований.

На основании данных о разведении в пробирке бактерии относят к чувствительным (S) к конкретному лекарственному веществу, если МИК значительно ниже критического значения этого показателя. Рост патогенных микроорганизмов со средним (MS) или промежуточным (IS) значением чувствительности угнетается при концентрации препарата, приближающейся к критическому значению МИК. Такие бактерии могут вызывать отрицательные реакции организма пациента или никак не воздействовать на него. МИК для резистентных (R) бактерий превышает критическое значение минимальной дозы. Эффективное значение концентрации в организме пациента такого препарата, воздействующего на определенный микроорганизм, вряд ли будет достигнуто. В таких случаях опасность кумуляции лекарственного вещества в токсических дозах может также перевесить потенциальную выгоду от применения терапии. Критическое значение минимальной дозы антибиотиков нового поколения, угнетающих рост бактерий, в некоторых случаях труднее определить в связи с переходом на профессиональную гибкую маркировку диапазонов дозировки.

Лекарственные вещества необходимо выбирать таким образом, чтобы при их применении в соответствии со схемой, препятствующей накоплению вещества в токсических дозах, можно было достигнуть предельной концентрации лекарственного вещества в плазме, существенно превышающей МИК. Многие бактерии будут чувствительны к воздействию определенного лекарственного вещества при концентрациях намного ниже критического значения минимальной дозы. Разницу между критическим значением и собственным значением МИК можно использовать для сравнения относительной эффективности различных антимикробных препаратов. Например, для амикацина критическое значение составляет 32 мкг/мл, поэтому Е. coli со значением МИК 2 мкг/мл имеет относительно большую чувствительность к амикацину, чем Е. coli со значением МИК 16 мкг/мл. Оба вида должны считаться чувствительными (хотя второй вид можно рассматривать как имеющий среднюю чувствительность), однако рост бактерий первого вида, по-видимому, угнетается в большей степени. Если тот же самый вид Е. coli со значением МИК 2 мкг/мл по отношению к амоксицилину имеет значение МИК 16 мкг/мл (при критическом значении 32 мкг/мл), то, по-видимому, росту этого микроорганизма будет легче воспрепятствовать путем применения амикацина, а не амоксицилина , посколь ку значение МИК амикацина дальше отстоит от своего критического значения МИК, чем значение МИК амоксициллина.

Несмотря на то, что различия между значениями МИК для конкретного вида бактерий и конкретного лекарственного вещества (16 или 32) могут казаться достаточно большими (в особенности в контексте предельной концентрации лекарственного вещества в плазме), такое отличие соответствует только одному раствору в пробирке. Это является примером опасности переоценки данных о чувствительности. Если значение МИК определенного организма находится достаточно близко к критическому значению, то в силу возможных расхождений в интерпретации данному микроорганизму может в одной лаборатории быть присвоена степень чувствительности "S" или "MS", а в другой - "R". Такие возможные расхождения в оценке являются одной из причин, по которой следует избегать использования лекарственных веществ, в отношении которых определенный организм обладает чувствительностью "MS" (или если значение МИК близко к критическому), за исключением случаев, если концентрация лекарственного вещества в очаге инфекции может намного превышать значение МИК, определенное при анализе in vitro. Наглядным примером может быть использование лекарственных веществ, выводимых почками, для лечения инфекции мочевыводящих путей или использование лекарственных веществ, выводимых с желчью, для лечения инфекции желчных путей. Накопление определенных лекарственных веществ лейкоцитами ( фторхинолоны , макролиды) может также привести к концентрации препарата в тканях, значительной превышающей МИК (или критическое значение МИК), несмотря на более низкую концентрацию в плазме.

МИК бактерий может изменяться при последующих инфекциях, вызванных бактерией того же самого вида, а также способна изменяться в самом процессе инфекционного заболевания. Увеличение значения МИК может просто отражать различный подход к оценке результатов анализа (в особенности если различия выявляются только при разведении в пробирке), однако может также считаться следствием выработки резистентности по отношению к определенному лекарственному веществу. В таких случаях курс антимикробной терапии может быть изменен за счет использования дополнительного препарата или перехода на новый, более эффективный препарат. При полимикробных инфекциях значение МИК определенного лекарственного вещества, вероятно, будет разным для каждой инфицирующей бактерии. Считается, что легче воспрепятствовать росту бактерий с низким значением МИК по отношению к определенному лекарственному веществу, чем росту микроорганизма с более высоким значением МИК по отношению к тому же самому лекарственному веществу.

(МАК) - это альвеолярная концентрация ингаля­ционного анестетика, которая предотвращает движение 50 % больных в ответ на стандартизо­ванный стимул (например, разрез кожи). МАК является полезным показателем, потому что отра­жает парциальное давление анестетика в головном мозге, позволяет сравнивать мощность различных анестетиков и представляет собой стандарт для экспериментальных исследований (табл. 7-3). Од­нако следует помнить, что МАК - статистически усредненная величина и ее ценность в практической анестезиологии ограничена, особенно на этапах, сопровождающихся быстрым изменением альвео­лярной концентрации (например, при индукции). Значения МАК различных анестетиков скла­дываются. Например, смесь 0,5 МАК закиси азота (53 %) и 0,5 МАК галотана (0,37 %) вызывает де­прессию ЦНС, приблизительно сопоставимую с депрессией, возникающей при действии 1 МАК энфлюрана (1,7 %). В отличие от депрессии ЦНС степени депрессии миокарда у разных анестети­ков при одинаковой МАК не эквивалентны: 0,5 МАК галотана вызывает более выраженное уг­нетение насосной функции сердца, чем 0,5 МАК закиси азота.

Рис. 7-4. Существует прямая, хотя и не строго линейная зависимость между мощностью анестетика и его жирораство-римостыо. (Из: Lowe H. J., Hagler K. Gas Chromatography in Biology and Medicine. Churchill, 1969. Воспроизведено с изменениями, с разрешения.)

МАК представляет собой только одну точку на кривой "доза-эффект", а именно - ЭД 50 (ЭД 50 %, или 50 % эффективная доза,- это доза лекарственно­го препарата, которая вызывает ожидаемый эффект у 50 % больных.- Примеч. пер.). МАК имеет клини­ческую ценность, если для анестетика известна фор­ма кривой "доза-эффект". Ориентировочно можно считать, что 1,3 МАК любого ингаляционного анес­тетика (например, для галотана 1,3 X 0,74 % = 0,96 %) предотвращает движение при хирургической стиму­ляции у 95 % больных (т. е. 1,3 МАК - приблизитель­ный эквивалент ЭД 95 %); при 0,3-0,4 МАК наступа­ет пробуждение (МАК бодрствования).

МАК изменяется под действием физиологичес­ких pi фармакологических факторов (табл. 7-4.). МАК практически не зависит от вида живого су­щества, его иола и длительности анестезии.

Закись азота

Физические свойства

Закись азота (N 2 O, "веселящий газ") - единствен­ное неорганическое соединение из применяющих­ся в клинический практике ингаляционных анес­тетиков (табл. 7-3). Закись азота бесцветна, фактически не имеет запаха, не воспламеняется и не взрывается, но поддерживает горение подобно кислороду. В отличие от всех остальных ингаляци­онных анестетиков при комнатной температуре и атмосферном давлении закись азота является га­зом (все жидкие ингаляционные анестетики с по­мощью испарителей преобразуют в парообразное состояние, поэтому их иногда называют парообра­зующими анестетиками.- Примеч. пер.). Под дав­лением закись азота можно хранить как жидкость, потому что ее критическая температура выше комнатной (см. гл. 2). Закись азота - относительно не­дорогой ингаляционный анестетик.

Влияние на организм

А. Сердечно-сосудистая система. Закись азота стимулирует симпатическую нервную систему, что и объясняет ее влияние на кровообращение. Хотя in vitro анестетик вызывает депрессию мио­карда, на практике артериальное давление, сердечный выброс и ЧСС не изменяются или немного увеличиваются вследствие повышения концентра­ции катехоламинов (табл. 7-5).

ТАБЛИЦА 7-3 . Свойства современных ингаляционных анестетиков

1 Представленные значения МАК рассчитаны для людей в возрасте 30-55 лет и выражены в процентах от одной атмосферы. При использовании в высокогорье для достижения того же парциального давления следует применять более высокую кон­центрацию анестетика во вдыхаемой смеси. * Если МАК > 100 %, то для достижения 1,0 МАК необходимы гипербарические условия.

Депрессия миокар­да может иметь клиническое значение при ИБС и гиповолемии: возникающая артериальная гипото­ния повышает риск развития ишемии миокарда.

Закись азота вызывает сужение легочной артерии, что увеличивает легочное сосудистое сопротивление (ЛСС) и приводит к повышению давления в правом предсердии. Несмотря на сужение сосу­дов кожи, общее периферическое сосудистое со­противление (ОПСС) изменяется незначительно.

ТАБЛИЦА 7-4. Факторы, влияющие на МАК

Факторы	Влияние на МАК	Примечания
Температура
Гипотермия	↓
Гипертермия	↓	, если >42°С
Возраст
Молодой
Старческий	↓
Алкоголь
Острое опьянение	↓
Хроническое потребление
Анемия
Гематокритное число < 10 %	↓
PaO 2
< 40 мм рт. ст.	↓
PaCO 2
> 95 мм рт. ст.	↓	Обусловлено снижением рН в ЦСЖ
Функция щитовидной железы
Гипертиреоз	Не влияет
Гипотиреоз	Не влияет
Артериальное давление
АД ср. < 40 мм рт. ст.	↓
Электролиты
Гиперкальциемия	↓
Гипернатриемия		Обусловлено изменением состава ЦСЖ
Гипонатриемия	↓
Беременность	↓
Лекарственные препараты
Местные анестетики	↓	Кроме кокаина
Опиоиды	↓
Кетамин	↓
Барбитураты	↓
Бензодиазепины	↓
Верапамил	↓
Препараты лития	↓
Симпатолитики
Метилдопа	↓
Резерпин	↓
Клонидин	↓
Симпатомиметики
Амфетамин
Хроническое употребление	↓
Острое опьянение
Кокаин
Эфедрин

Так как закись азота повышает концентрацию эн­догенных катехоламинов, ее использование увели­чивает риск возникновения аритмий.

Б. Система дыхания. Закись азота увеличивает частоту дыхания (т. е. вызывает тахипноэ) и сни­жает дыхательный объем в результате стимуляции ЦНС и, возможно, активации легочных рецепто­ров растяжения. Суммарный эффект - незначи­тельное изменение минутного объема дыхания и PaCO 2 в покое. Гипоксический драйв, т. е. увеличе­ние вентиляции в ответ на артериальную гипоксе­мию, опосредованное периферическими хеморе-цепторами в каротидных тельцах, значительно угнетается при использовании закиси азота даже в невысокой концентрации. Это может привести к серьезным осложнениям, возникающим у пациента в послеоперационной палате пробуждения, где не всегда удается быстро выявить гипоксемию.

В. Центральная нервная система. Закись азота увеличивает мозговой кровоток, вызывая некото­рое повышение внутричерепного давления. Закись азота также увеличивает потребление кислорода головным мозгом (CMRO 2). Закись азота в кон­центрации, меньшей 1 МАК, обеспечивает адек­ватное обезболивание в стоматологии и при вы­полнении малых хирургических вмешательств.

Г. Нервно-мышечная проводимость. В отли­чие от других ингаляционных анестетиков закись азота не вызывает заметной миорелаксации. На­оборот, в высокой концентрации (при использова­нии в гипербарических камерах) она вызывает ри­гидность скелетной мускулатуры. Закись азота, вероятнее всего, не провоцирует злокачественную гипертермию.

Д. Почки. Закись азота уменьшает почечный кровоток вследствие повышения почечного сосу­дистого сопротивления. Это снижает скорость клубочковой фильтрации и диурез.

ТАБЛИЦА 7-5. Клиническая фармакология ингаляционных анестетиков

	Закись азота	Галотан	Метокси- флюран	Энфлюран	Изофлю-ран	Десфлю-ран	Сево-флюран
Сердечно-сосудистая система
Артериальное давление	±	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓
ЧСС	±	↓				± или
ОПСС	±	±	±	↓	↓↓	↓↓	↓
Сердечный выброс 1	±	↓	↓	↓↓	±	± или ↓	↓
Система дыхания
Дыхательный объем	↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓	↓
Частота дыхания
PaCO 2 в покое	±
PaCO 2 при нагрузке
ЦНС
Мозговой кровоток
Внутричерепное давление
Метаболические потребности мозга 2		↓	↓	↓	↓↓	↓↓	↓↓
Судороги	↓	↓	↓		↓	↓	↓
Нервно-мышечная проводимость
Недеполяризующий блок 3
Почки
Почечный кровоток	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓	↓
Скорость клубочковой фильтрации	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	?	?
Диурез	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓↓	?	?
Печень
Кровоток в печени	↓	↓↓	↓↓	↓↓	↓	↓	↓
Метаболизм 4 О	,004 %	15-20%	50%	2-5 %	0,2 %	< 0, 1 %	2-3 %

Примечание:

Увеличение;

↓ - уменьшение; ± - изменений нет; ? - неизвестно. 1 Ha фоне ИВЛ.

2 Метаболические потребности мозга повышаются, если энфлюран вызывает судороги.

Анестетики скорее всего пролонгируют и деполяризующий блок, но этот эффект не имеет клинического значения.

4 Часть от поступившего в кровь анестетика, которая подвергается метаболизму.

E. Печень. Закись азота снижает кровоток в пе­чени, но в меньшей степени, чем другие ингаляци­онные анестетики.

Ж. Желудочно-кишечный тракт. В некоторых работах доказано, что закись азота вызывает тош­ноту и рвоту в послеоперационном периоде в ре­зультате активации хеморецепторной триггерной зоны и рвотного центра в продолговатом мозге. В исследованиях других ученых, наоборот, не об­наружено никакой связи между закисью азота и рвотой.

В принципе эта процедура сходна с определением МПК в жидкой "Среде. Готовят несколько чашек Петри со ступенчатыми разведениями антибиотика, растворенного в дайной среде. Добавляют расплавленный агар, чашки охлаждают, чтобы агар затвердел. На поверхности среды штрихом засевают культуры одной или нескольких бактерий и после инкубации в термостате в течение необходимого времени определяют минимальную концентрацию антибиотика, при которой подавляется рост бактерий. Одним из преимуществ этого метода перед методом титрования в жидкой среде является то, что разные участки одной и той же чашки можно засевать разными видами или штаммами бактерий. В результате величины МПК для нескольких бактерий можно определить в одном опыте (рис. 2.2).

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ

МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАРЕ
Этот метод применяется для определения концентрации антибиотика в растворе. Он состоит в следующем. Диски из фильтровальной бумаги, смоченные исследуемым раствором антибиотика, помещают на поверхность агаризованной среды, содержащей разведенную суспензию бактерий. После соответствующей инкубации поверхность агара, которая вначале была полупрозрачной, мутнеет из-за рассеяния света выросшими бактериями. Полупрозрачные зоны остаются лишь вокруг дисков фильтровальной бумаги, поскольку антибиотик диффундирует в агар и подавляет рост бактерий. Если диаметр этих зон определять при строго стандартных условиях, то он будет функцией логарифма концентрации антибиотика. Используя известные концентрации антибиотика, строят стандартную кривую, по которой можно определить концентрацию антибиотика в неизвестных растворах (рис. 2.3). Иногда вместо дисков из фильтровальной бумаги используют небольшие полые цилиндрики, поставленные на поверхность агаровой среды и содержащие раствор антибиотика.

1. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ОПРЕДЕЛЕНИЕ

АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ
Активность антибиотиков in vitro зависит от условий определения (табл. 2.1). На определение активности влияют такие факторы, как состав среды, плотность инокулума, количество бактериальных клеток в иноку луме (величина инокулума).

/

Таблица 2.1. Факторы, влияющие на определение активности антибиотиков
Тест-организм
Состав среды (pH, ионы, сыворотка, антагонисты)
Величина и плотность инокулума (гетерогенность популяции, механизмы инактивации, попадание веществ-антагонистов)
Условия инкубации (время, температура, аэрация)
А. СОСТАВ СРЕДЫ
Рассмотрим в качестве примера антибиотик, подавляющий биосинтез одной из аминокислот. Если антибиотик испытывают в среде без этой аминокислоты, то кажется, что он обладает очень высокой активностью, другими словами, имеет низкую величину МПК. При испытании в "среде, содержащей аминокислоту, синтез которой он подавляет и которую бактерия может получать из среды, антибиотик будет казаться неактивным.
Помимо таких специфических эффектов часто наблюдается менее специфическое влияние среды, не связанное непосредственно с механизмом действия или с химической структурой антибиотика. Одним особенно интересным случаем является наличие в среде сыворотки. Ее вводят в среду при определении МПК, чтобы создать физиологические условия, напоминающие условия в крови. Многие антибиотики связываются с белками сыворотки крови (в особенности с альбумином), в результате число свободных молекул антибиотика, которые могут проникать в бактериальные клетки, снижается. Связывание антибиотика с белками сыворотки обычно коррелирует с липофильностью некоторых заместителей в его молекуле.
Очевидно, что условия определения МПК в жидкой среде отличаются от условий в плотной среде хотя бы потому, что в плотной среде присутствует агар. Агар, содержащий S03-rpyn- пы, может адсорбировать антибиотик, изменяя его диффундирующую способность, или адсорбировать растворенный кислород и некоторые компоненты питательной среды. Неудивительно поэтому, что величина МПК антибиотика в отношении данной бактерии зависит от того, определена ли она в жидкой или в плотной среде, даже если эти две среды, за исключением наличия или отсутствия агара, идентичны по составу. Нужно также помнить, что физиология клеток может различаться в зависимости от того, растут ли они поодиночке в жидкости или в виде колоний на поверхности плотной среды.
Очень сильное влияние на активность антибиотиков оказывает величина pH среды. Помимо второстепенных эффектов, как то влияние pH на скорость роста микроорганизмов и, следова-
тешыно, косвенное влияние на их восприимчивость, величина pH оказывает очень сильное и непосредственное действие на способность препарата проникать,в бактериальную клетку. Например, вещества в неионизированной форме лучше диффундируют через клеточную стейку и плазматическую мембрану, чем вещества в ионизированной форме. Таким образом, pH среды, определяя степень ионизации основного или.кислого антибиотика, может прямо влиять на скорость его проникновения в бактерии и, следовательно, на эффективность.
Б. ПЛОТНОСТЬ И ВЕЛИЧИНА БАКТЕРИАЛЬНОГО ИНОКУЛУМА
Плотность инокулума - это число засеваемых бактерий, отнесенное к объему, в котором они растут. Ее обычно выражают как число клеток в 1 мл культуры. Величина инокулума - общее число засеянных бактерий. На МПК многих антибиотиков не влияют вариации в плотности обычно используемого инокулума (103-106 бактерия/мл). Действительно, даже при очень низких концентрациях антибиотика, например 0,01 мкг/мл, отношение числа молекул антибиотика к числу бактериальных клеток остается очень большим (при концентрации антибиотика с мол. массой 1000, равной 0,01 мкг/мл, в 1 мл раствора содержится ~1012 молекул). Однако имеются некоторые исключения. Например, зачастую очень много молекул антибиотика адсорбируется на наружной поверхности бактериальной клетки. Если плотность бактерий высока, число свободных молекул антибиотика, которые могут проникнуть в клетку, очень сильно снижается. Кроме того, для подавления роста одной клетки часто бывает необходимо большое количество молекул антибиотика. По мере роста бактерии синтезируют и выделяют в среду ферменты, которые могут разрушать антибиотик (например, р-лакта- мазы, действующие на р-лактамные антибиотики; см. гл. 4). Количество разрушенного антибиотика является функцией концентрации фермента в питательной среде и, следовательно, зависит от величины инокулума.
На первый взгляд кажется, что, если плотность культуры бактерий одинакова, не важно, исследуется ли активность антибиотика в маленьких объемах, например 0,25 мл и меньше в миниатюризованных системах, или в объеме 10 мл в обычных лабораторных пробирках. Если все бактерии в популяции идентичны, никакой разницы в результатах не будет.
Когда общее число бактерий в инокулуме очень велико, повышается вероятность того, что в среде будут присутствовать клетки, менее восприимчивые к антибиотику. Рост всех восприимчивых клеток будет подавлен, однако менее восприимчивые (в принципе это может быть даже единственная клетка) будут размножаться, и после инкубации в течение 18 ч образуется по-

Таблица 2.2. Факторы, влияющие на активность некоторых антибиотиков

пуляция бактерий с высокой плотностью. Значительная вариабельность величины МПК с изменением числа инокулирован- ных клеток обычно свидетельствует о высокой частоте мутантов, устойчивых к антибиотику (гл. 4). Частота появления устойчивых мутантов неодинакова для разных антибиотиков. В случае антибиотиков, используемых в клинике, она колеблется от 10~7 до 10-10.
В этом разделе описаны далеко не все факторы, которые могут влиять на активность антибиотика в отношении определенной бактерии (табл. 2.2). Поэтому, чтобы использовать подавление роста бактерий для количественного определения активности антибиотиков и получить данные, которые можно воспроизвести в разных лабораториях, необходимо, чтобы все условия были точно определены и по возможности стандартизованы.

Критериями антимикробной активности препарата являются минимальная подавляющая концентрация (МПК) и минимальная бактерицидная концентрация (МБК). МПК – это наименьшая концентрация антибиотиков, которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий. Она выражается в мг/л или мкг/мл. МБК – это наименьшая концентрация антибиотика, которая вызывает бактерицидный эффект. Для её определения необходимо провести высев из пробирок (визуально отсутствует рост) на плотный питательный агар, не содержащий антибиотик. Этот показатель имеет большое клиническое значение. На основе метода серийных разведений созданы микрометоды, предусматривающие использование меньшего объёма питательной среды. В настоящее время для проведения такого рода исследований выпускаются многочисленные коммерческие наборы, состоящие из высушенных стабилизированных разведений антибиотиков, которые разбавляются суспензией тест-микроба. Данные наборы могут храниться в обычных условиях, вследствие чего исключается необходимость в приготовлении разведений среды и антибиотиков в лабораторных условиях. Достоинством тестов микроразведений является также то, что они включаются в автоматизированную систему.

На основании полученных данных (диаметра зоны задержки роста или величины МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно-резистентные и резистентные. Для разграничения этих категорий используют так называемые пограничные концентрации антибиотиков, которые не являются неизменными величинами. Они пересматриваются по мере изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты, микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (N ational C ommittee for C linical L aboratory S tandards – NCCLS), организованный в США. В настоящее время стандарты NCCLS используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная подавляющая концентрация (МПК) или минимальная ингибирующая концентрация (МИК) антибиотика, задерживающая рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта.

Для определения лекарственной устойчивости используют суточную чистую культуру возбудителя, выделенную из организма больного, и стандартную питательную среду (АГВ или Мюллер-Хинтон агар) для её посева.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят диско-диффузионным методом или методом серийных разведений антибиотика в жидких или плотных средах.

Диско-диффузионный метод

Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков основано на диффузии антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам. Эта концентрация соответствует средней терапевтической дозе для стандартных штаммов микроорганизмов.

Приготовленную взвесь микроорганизмов засевают на поверхность специальной среды (АГВ или агар Мюллер-Хинтона) в чашки Петри. Затем стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков (также можно использовать специальные устройства и диспенсеры). Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий. Если бактерии чувствительны к данному антибиотику, то вокруг диска образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам, в которых указаны диаметры зон задержки роста стандартных культур, чувствительных, устойчивых и умеренно-устойчивых.

Метод дисков не даёт надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксину, ристомицину). Также этот метод не позволяет определить минимальную подавляющую концентрацию антибиотика.