Бактериологический метод диагностики цель этапы. Этапы бактериологического метода исследования. Цель: идентификация выделенной чистой культуры

Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

· морфология и тинкториальные свойства

· культуральные свойства (характер роста на питательных средах)

· биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)

· серологические свойства (антигенные)

· вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)

· патогенность для животных

· фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)

· чувствительность к антибиотикам

· другие индивидуальные свойства

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.

При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.

Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 11. Схема изучения колоний

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.

Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°С на сутки.

Заключение

Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

Исследование бактерий имеет большое практическое значение для человека. На сегодняшний день открыто большое количество прокариот, которые отличаются друг от друга по патогенности, области распространения, форме, размерам, количеству жгутиков и другим параметрам. Чтобы детально изучить данный штамм, применяется бактериологический метод исследования.

Какие существуют методы клеток?

Чтобы определить, являются ли бактерии патогенными, проводят исследование культуры различными способами. Среди них:

1. Бактериоскопический метод.

2. Бактериологический метод.

3. Биологический метод.

Бактериоскопический и бактериологический основаны непосредственно на работе с клетками прокариот, когда биологический анализ требуется для изучения влияния таких клеток на живой организм подопытных животных. По степени проявления тех или иных признаков заболевания ученый может сделать вывод о наличии или отсутствии патогенных бактерий в пробе, а также естественно их размножить в организме животного для получения их культуры и использования в других работах.

Бактериологический метод исследования отличается от бактериоскопического. В первом для анализа используется специально подготовленная культура живых прокариот, когда во втором проводится работа с мертвыми или живыми клетками на предметном стекле.

Этапы бактериологического метода исследования. Микробиология

Принцип изучения свойств бактериальной культуры может пригодиться как для ученых-микробиологов, которые поставили цель исследовать прокариотические клетки, так и для лаборантов, задача которых заключается в установлении патогенности или непатогенности бактерий, а затем диагноза пациента.

Методика изучения бактерий делится на три этапа:

1. Выделение бактерий из первоначальной пробы.

2. Высевание бактерий и выращивание изучение ее свойств.

Первый этап

Проба, или мазок, берется со свободной поверхности среды или у пациента. Таким образом мы получаем «коктейль» из множества видов бактерий, которые должны высеять на питательную среду. Иногда появляется возможность выделить сразу необходимые бактерии, зная их очаги распространения в организме.

Через двое-трое суток отбираются нужные колонии и высеваются на твердые среды чашек Петри с помочью стерильной петли. Во множестве лабораторий работают с пробирками, где может находиться твердая или жидкая питательная среда. Так и проводится бактериологический метод исследования в микробиологии.

Второй этап

После получения отдельных колоний бактерий проводится непосредственный макро- и микроанализ. Измеряются все параметры колоний, определяется цвет и форма каждой из них. Нередко проводится подсчет колоний на чашке Петри, а затем в исходном материале. Это имеет значение при анализе патогенных бактерий, от числа которых зависит степень заболевания.

Бактериологический метод исследования, 2 этап которого заключается в изучении отдельных колоний микроорганизмов, может быть сопряжен с биологическим способом анализа бактерий. Еще одна цель работы на этом этапе - увеличить количество исходного материала. Это можно сделать на питательной среде, а можно провести эксперимент в естественных условиях на живых подопытных организмах. Патогенные бактерии будут размножаться, и в результате кровь будет содержать миллионы клеток прокариот. Из взятой крови легко приготовить необходимый рабочий материал бактерий.

Третий этап

Самая важная часть исследования - это определение морфологических, биохимических, токсигенных и антигенных свойств культуры бактерий. Работа ведется с заранее «очищенными» культурами на питательной среде, а также с препаратами (зачастую окрашенными) под микроскопом.

Установить принадлежность патогенных или условно-патогенных бактерий к той или иной систематической группе, а также определить их устойчивость к лекарствам позволяет бактериологический метод исследования. 3 этап - антибиотики, т. е. анализ поведения клеток бактерий в условиях содержания лекарственных препаратов в окружающей среде.

Исследование устойчивости культуры к антибиотику имеет важное практическое значение, когда необходимо прописать для конкретного пациента необходимые, а главное, действенные препараты. Здесь и может помочь бактериологический метод исследования.

Что такое питательная среда?

Для развития и размножения бактерии должны находиться в заранее подготовленных питательных средах. По консистенции они могут быть жидкие или твердые, а по происхождению - растительные или животные.

Основные требования к питательным средам:

1. Стерильность.

2. Максимальная прозрачность.

3. Оптимальные показатели кислотности, активности воды и других биологических величин.

Получение изолированных колоний

1. Метод Дригальского. Он заключается в том, что на бактериальную петлю наносится мазок с различными видами микроорганизмов. Этой петлей проводят по первой чашке Петри с питательной средой. Далее, не меняя петлю, методом остаточного материала проводят по второй и третьей чашкам Петри. Так, на последних образцах колонии бактерии будут засеваться не слишком плотно, тем самым упрощается возможность найти необходимые для работы бактерии.

2. Метод Коха. В нем используются пробирки с расплавленной питательной средой. Туда помещается петля или пипетка с мазком бактерий, после чего содержимое пробирки выливается на специальную пластинку. Агар (или желатин) застывает через какое-то время, а в его толще легко обнаружить нужные колонии клеток. Важно перед началом работы развести смесь бактерий в пробирках, чтобы концентрация микроорганизмов не была очень большой.

Этапы которого основаны на выделении нужной культуры бактерий, не обходится без этих двух способов нахождения изолированных колоний.

Антибиотикограмма

Визуально реакцию бактерий на препараты можно заметить двумя практическими способами:

1. Метод бумажных дисков.

2. Разведение бактерий и антибиотика в жидкостной среде.

Метод бумажных дисков требует наличия культуры микроорганизмов, которые были выращены на твердой питательной среде. На такую среду кладут несколько бумажек округлой формы, пропитанных антибиотиками. Если препарат успешно справляется с нейтрализацией бактериальных клеток, после такой обработки останется участок, лишенный колоний. Если же реакция на антибиотик отрицательная, бактерии выживут.

В случае использования жидкой питательной среды сперва готовят несколько пробирок с культурой бактерий разных степеней разведения. В эти пробирки добавляют антибиотики, и в течение суток наблюдают за процессом взаимодействия вещества и микроорганизмов. В конечном итоге получается качественная антибиотикограмма, по которой можно судить об эффективности препарата для данной культуры.

Основные задачи анализа

Здесь перечислены по пунктам цели и этапы бактериологического метода исследования.

1. Получить исходный материал, который будет использоваться для выделения колоний бактерий. Это может быть мазок с поверхности любого предмета, слизистой оболочки или полости органа человека, анализ крови.

2. на твердой питательной среде. Через 24-48 часов на чашке Петри можно обнаружить колонии бактерий разных видов. Отбираем по морфологическим и/или биохимическим критериям нужную и проводим уже с ней дальнейшую работу.

3. Размножение полученной культуры. Бактериологический метод исследования может опираться на механический или биологический способ увеличения численности культуры бактерии. В первом случае ведется работа с твердыми или жидкими питательными средами, на которых в термостате размножаются бактерии и образуют новые колонии. Биологический способ требует естественных условий увеличения численности бактерий, поэтому здесь микроорганизмами заражается подопытное животное. Через несколько суток в пробе крови или мазке можно обнаружить множество прокариот.

4. Работа с очищенной культурой. Чтобы определить систематическое положение бактерий, а также их принадлежность к возбудителям заболеваний, необходимо провести тщательный анализ клеток по морфологическим и биохимическим признакам. При исследовании патогенных групп микроорганизмов важно знать, насколько эффективно действие антибиотиков.

Это была общая характеристика бактериологического метода исследования.

Особенности проведения анализа

Главное правило проведения бактериологического исследования - это максимальная стерильность. Если идет работа с пробирками, посевы и пересевы бактерий должны проводиться только над нагретой спиртовкой.

Все этапы бактериологического метода исследования требуют использования специальной петли или пастеровской пипетки. Оба инструмента должны быть предварительно обработаны в пламени спиртовки. Что касается пастеровской пипетки, то тут перед термической стерилизацией необходимо отломать кончик пипетки пинцетом.

Техника посева бактерий тоже имеет свои особенности. Во-первых, при посеве на твердые среды проводят бактериальной петлей по поверхности агара. Петля, конечно же, уже должна иметь на поверхности образец микроорганизмов. Также практикуется посев внутрь и в этом случае петля или пипетка должны достичь дна чашки Петри.

При работе с жидкими средами используются пробирки. Здесь важно следить, чтобы жидкости не касались краев лабораторной посуды или пробки, а используемые инструменты (пипетка, петля) не дотрагивались до посторонних предметов и поверхностей.

Значение биологического метода исследования

Анализ пробы бактерий имеет свое практическое применение. Прежде всего бактериологический метод исследования может использоваться в медицине. К примеру, необходимо изучить микрофлору больного, чтобы установить правильный диагноз, а также выработать правильный ход лечения. Здесь помогает антибиотикограмма, которая покажет активность лекарственных препаратов против возбудителя заболеваний.

Анализ бактерий используется в лаборатории для определения таких опасных заболеваний, как туберкулез, возвратный тиф или гонорея. Также он применяется для изучения бактериального состава миндалин, полостей органов.

Бактериологический метод исследования можно использовать для определения загрязненности среды. По данным о количественном и качественном составе мазка с поверхности какого-либо предмета определяется степень заселенности данной среды микроорганизмами.

Диагностика инфекционных заболеваний необходима для последующего проведения адекватной этиотропной терапии, направленной на уничтожение возбудителя патологического процесса. Выявление и идентификация патогенных микроорганизмов проводится при помощи различных методик лабораторной диагностики, одним из которых является бактериологическое исследование.

Бактериология как наука получила развитие в XIX веке благодаря внедрению бактериологических методик исследования.

Принцип и суть методики

Основной целью бактериологического исследования является выявление и последующая идентификация патогенного (болезнетворного) микроорганизма в исследуемом материале. Для этого проводится посев на специальные питательные среды (мясо-пептонный бульон, плотная среда агар), на котором при наличии возбудителя в материале через некоторое время вырастают колонии микроорганизмов. Их идентифицируют по микроскопическим (размер клеток, их форма, определенный цвет при окрашивании по Граму), биохимическим (способность расщеплять некоторые углеводы или
белки) и антигенным (взаимодействие с антителами к основным классам возбудителя) свойствам. В целом на проведение данной методики диагностики требуется от 48 до 72 часов, что достаточно долго (особенно при необходимости быстрого начала этиотропной терапии инфекционной патологии). Тем не менее данный вид лабораторной диагностики не теряет своей актуальности на сегодняшний день, так как является достоверным для большого количества инфекционных заболеваний.

Очень часто во время бактериологического исследования дополнительно проводится определение чувствительности выделенного патогенного микроорганизма к основным группам современных антибиотиков. Это дает возможность в последующем подобрать наиболее эффективную этиотропную терапию.

Когда проводится бактериологическая диагностика

Показанием к проведению бактериального исследования служит диагностика различных инфекционных заболеваний, к которым относятся:

Также данная методика может проводится для определения возбудителя гнойных процессов различной локализации. В первую очередь это необходимо для определения чувствительности выявленных микроорганизмов к антибиотикам, так как при развитии гнойного процесса возбудители часто являются устойчивыми к большинству антибиотиков.

Диагностика дисбактериоза при помощи бактериологического исследования дает возможность определить вид условно-патогенных микроорганизмов, а также их количество, на основании чего делается заключение о выраженности нарушения нормальной микрофлоры.

Материалом при бактериологическом исследовании служит моча, кровь, мазки из полости носа, уретры, влагалища, прямой кишки, кал, сперма у мужчин, мокрота. Выбор материала зависит от показаний к проведению данного метода лабораторной диагностики и локализации патологического процесса.

Расшифровка результатов

В большинстве случаев результат исследования основывается на 2-х показателях - факт наличия выявляемого
микроорганизма (положительный или отрицательный результат), а также количество бактериальных клеток на единицу объема исследуемого материала (данный показатель имеет место только при положительном результате). Численность бактерий выражается в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ). Чем выше данный показатель, тем большее количество бактерий в исследуемом материале. Также результат может включать показатели чувствительности выявленного микроорганизма к антибиотикам. Он обычно состоит из списка основных классов антибактериальных средств (

Бактериологический метод исследования патматериала на предмет выделения и идентификации микобактерий включает 3 способа: бактериоскопический, культуральный и биологический / Р.В.Ткзова, 1983; И.И.Румачик, 1987,1993; А.С. Донченко, 1989; Ю.Я. Кассича, 1990; А.Х.Найманов, 1993; Л.П.Ходун, 1997/. Срок бактериологического исследования не должен превышать 3-х месяцев.

Учитывая, что макроскопические туберкулезные изменения в органах и тканях крупного рогатого скота вызывает возбудитель туберкулеза бычьего вида, исследовать такой материал бактериологически не имеет смысла. Если такой материал доставлен в лабораторию для исследования, то производят комиссионный осмотр и составляют акт. Материал обезвреживают.

Бактериоскопическое (микроскопическое) исследование материала заключается в приготовлении из каждого органа (или кусочков органа с подозрительными на туберкулез изменениями) и лимфатического узла, доставленных для исследования, по 2 мазка-отпечатка, высушивании их на воздухе, фиксации над пламенем спиртовки, окрашивании по Циль-Нильсену и просмотре окрашенных мазков под микроскопом, причем не менее 50 полей зрения в каждом мазке. Необходимо приготовить, как минимум, 20 мазков-отпечатков из материала от одной туши. Кроме того, мазки для микроскопии готовят также и из высеваемой на питательные среды взвеси материала.

Окраска мазков по Цилю-Нильсену является избирательной на выявление микобактерий: на синем фоне окрашенных тканей или посторонней микрофлоры микобактерии просматриваются как красные, розовые или рубиново-красные палочки. Лучше всего просмотр мазков вести под микроскопом-бинокуляром при увеличении 1,5 (насадка) х 7 (окуляр) х 90 или 100 (объектив).

Способ используют как сигнальный, поскольку наличие или отсутствие микобактерий в мазках абсолютно не влияет на ход дальнейших исследований и даже положительное заключение бактериоскопии не имеет юридической значимости (кроме птиц). Материал необходимо исследовать далее.

Лабораторный диагноз на туберкулез у птиц считают установленным, если из исследуемого материала выделена культура микобактерий птичьего вида (от попугаев - человечьего или птичьего видов), получен положительный результат биопробы, а также при обнаружении микобактерий в мазках из патологического материала при микроскопическом исследовании (п. 7.3.2. наставления).

Необходимо обратить внимание также и на то, что на приготовление мазков-отпечатков, их фиксацию и просмотр уходит очень много времени, а обнаружить в них микобактерии удается очень редко, даже в мазках из высеваемой взвеси материала. Поэтому в целях экономии рабочего времени и средств при исследовании материала от животных, не имевших изменений при убое, целесообразно ограничиться приготовлением и просмотром мазков только из высеваемой на питательные среды взвеси материала. Это не приведет к ущербу в диагностике туберкулеза, ведь исследование материала продолжается далее.

Кроме обычной световой микроскопии можно использовать люминесцентную микроскопию. Мазки готовят аналогичным образом, фиксируют и окрашивают смесью флуорохромов. Окрашенные мазки просматривают под люминесцентным микроскопом. Способ более чувствителен, однако менее специфичен, и поэтому мало приемлем, особенно в условиях практических лабораторий.

Культуральное выделение микобактерий на питательных средах является одним из важных звеньев в лабораторной диагностике туберкулеза на современном этапе. Однако питательные среды, на которые был высеян материал (на 5-10 пробирок в соответствии с наставлением), в первые 2-3 недели имеют частичный или полный пророст, как правило, из-за нарушения стерильности при посеве материала. Посевы выбраковываются как раз в тот период, когда вероятнее всего проявление первоначального роста атипичных микобактерий (не говоря уже о проявлении первоначального роста возбудителя туберкулеза, который проявляет рост еще позже). В таких случаях культуральный способ выделения микобактерий на питательных средах механически выпадает. Это одна из основных причин получения отрицательных результатов при бактериалогическом исследовании материала. В результате, не получив роста колоний микобактерий на питательных средах после посева материала, а лабораторные животные остались живы в течение 3-х месяцев, следует стандартный ответ лабораторий: «Возбудитель туберкулеза не выделен» или «Экспертиза материала на туберкулез отрицательная». На основании результатов проведенных исследований причина реагирования крупного рогатого скота на туберкулин не установлена, и это ведет к дальнейшему необоснованному убою значительного количества реагировавших на туберкулин животных в хозяйствах, благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, что наносит большой экономический ущерб, нарушает оборот и воспроизводство стада.

Учитывая вышеизложенное, необходимо первоочередное внимание уделять культуральному способу выделения микобактерий из материала на питательных средах, как самому слабому звену в бактериалогической диагностике туберкулеза в районных ветеринарных лабораториях.

Положительные результаты культурального метода выделения микобактерий зависят, в основном, от двух обстоятельств: увеличение достоверности высева микобактерий из материала и соблюдение условий стерильности при работе в боксе.

Увеличение достоверности высева микобактерий из взятого для исследования материала зависит, в первую очередь, от качественного его отбора, предпосевной обработки и увеличения количества пробирок среды, на которого производят посев.

Основные условия, соблюдение которых при посеве материала на питательные среды гарантирует получение рост колоний микобактерий:

а) отбирать материал для бактериологического исследования от убитых животных, не имевших изменений при убое, отдельно от каждой туши и высевать на 10-20 пробирок среды каждую пробу (материал от каждого животного) по следующей схеме:

Лимфатические узлы головы (подчелюстные, заглоточные);

Бронхиальные и средостенные лимфатические узлы;

Мезентериальные (брыжеечные) лимфоузлы;

Прочие лимфоузлы (при наличии подозрительных участков);

Органы (тоже при необходимости).

В результате получается посев материала от одного животного на 30-50 пробирок среды. Этим достигается увеличение достоверности высева микобактерий в 3-5 раз, так как без разделения проб (по наставлению) высев материала рекомендуется проводить всего на 5-10 пробирок среды от двух голов одной фермы.

б) Непосредственно при бактериологическом посеве материала вырезать кусочки с нарушенной морфологической структурой лимфатического узла или органа (гиперплазия, уплотнение, точечные и полосчатые кровоизлияния и т.д.). Причем необходимо вырезать все измененные участки. Если материала по объему получается много в одну ступку, то его можно разделить в две.

в) Строго соблюдать взятую для работы методику, не нарушая режим обработки и высева материала.

г) При гомогенизации материала, особенно лимфатических узлов, необходимо использовать стерильный песок или мелкобитое стерильное стекло. Максимально растирать материал (до сметанообразной консистенции) для лучшего извлечения микобактерий из исследуемого материала

д) Добавлять физраствор к гомогенизированному материалу в ступку в количестве, необходимом для высева взвеси материала на питательные среды и для биопробы (в среднем до 0,5 см3 в одну пробирку и 1 -2 см3 для подкожного заражения одной морской свинки). Это количество физраствора можно рассчитать заранее.

е) Просмотр посевов материала проводить через 3, 5, 7, 10, 15 дней и в дальнейшем один раз в неделю.

ж) Любая выросшая на среде колония микроорганизмов (типичная или атипичная, пигментная или беспигментная, слизистая или суховатая и т.д.) должна пройти микроскопию при избирательной окраске по Циль-Нильсену.

Следует обратить внимание на степень отмывки материала от кислоты (или щелочи), применяемой для обработки материала от контаминации посторонней микрофлорой. Остаточное количество кислоты всегда будет присутствовать во взвеси из высеваемого материла, однако оно должно быть минимальным. Показателем этого служит восстановление первоначального цвета среды на 2-4-ый день после посева материала. Если цвет среды не восстановился, это свидетельствует о повышенном количестве остаточной кислоты. Цвет среды приобретает синеватый оттенок различной интенсивности. Рост (предполагаемых) микобактерий в данном случае замедляется, либо его не будет вообще, особенно возбудителя туберкулеза как более требовательного к режиму культивирования. Остаточное количество кислоты действует на микобактерии в некоторой степени бактериостатически.

Для герметизации пробирок после посева материала можно применять ватные и ватно-марлевые пробки с последующей заливкой их парафином, резиновые без- и резиновые с вырезанным косым желобком, корковые и металлические пробки (затворы).

При определении видовой принадлежности выделенной культуры микобактерий известно много (около 300) различных тестов: культурально-морфологические, биологические, биохимические, серологические, определение лекарственной устойчивости и т.д. Однако в ветеринарной практике применяется их минимум (см. наставление). Для лабораторий достаточно определение выделенной культуры микобактерий следующих видов: бычий, человечий и птичий, что определяется биопробой, а атипичные микобактерии - разделить на группы по Runyon (1959): I - фотохромогенные (образующие пигмент под воздействием света), II - скотохромогенные (образующие пигмент независимо от воздействия света - и в темноте, и на свету), III - нехромогенные (не образующие пигмента) или еще их называют беспигментные (сюда же отнесен и возбудитель туберкулеза птичьего вида), IV - быстрорастущие микобактерии и кислоустойчивые сапрофиты.

Для этого достаточно эффективно и экономически оправдано изучение свойств выделенной культуры по сокращенной схеме, в которой основное внимание уделяется срокам появления первичного роста колоний, пигментообразованию, культурально-морфологическим и тинкториальным свойствам при окраске по Цилю-Нильсену. Особенно значим тест на корд-образование в первичной или даже в субкультуре в сочетании с результатами биопробы. Для приготовления мазков из выросших колоний целесообразно одновременно делать их как из колоний, так и из остатков взвеси и конденсата, т.е. с жидкой части на дне пробирки.

Кроме того, сотрудники лабораторий имеют возможность не только проводить контрольный убой реагировавших на туберкулин животных и отбирать пробы материала для исследования, но и отбирать для бактериологического исследования при жизни животных (бронхиальная или носовая слизь, молоко, фекалий, моча, экссудат, кровь и т.д.), а также пробы кормов, воды, объектов внешней среды на предмет выделения микобактерий и, таким образом, косвенно доказывать причину реагирования скота на туберкулин. При посеве дополнительного материала и проб из объектов внешней среды используют общеизвестные методы концентрирования микобактерий: седиментационный, флотационный, флотационно-седиментационный и другие.

Сокращенная схема дифференциации микобактерий с использованием биопробы

Культуральный метод исследования представляет собой выделение из питательной среды бактерий определённого вида путём культивирования, с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей.

Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой. После окончательной идентификации их характеристик, бактерии, выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.

1 этап

А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение и транспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости от свойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.

Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.

В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.

Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.

Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.

Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.

2 этап

А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности. Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.

Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре (для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).

Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера. Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:

· 0,1% глюкозы;

· 1% лактозы;

· Специальный реактив на сероводород;

· Феноловый красный индикатор.

3 этап

А)Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.

Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.

Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).

В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.

Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.

E. coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.

S. paratyphi – способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.

S. paratyphi A- не продуцирует сероводород.

S. paratyphi B – сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).

S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.

Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.

Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.

В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.